高效液相色谱仪常见问题汇总 高效液相色谱仪常见问题汇总图

高效液相色谱荧光检测仪出问题怎么办?

转载：《分析测试百科网》

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检测器故障和解决方法

1.检测器性质概述

检测器是液相色谱系统的“眼睛”，测量离开柱的样品的浓度或质量。光电检测器测量柱流出物的光吸收、荧光和折光率的变化。电化学和电导检测器溶液的变化。特殊的样品用特殊的检测器。不合适的检测器测得的结果也不可靠。

2.常出现的UV检测器故障

故障类型 故障率（%）

噪音 26

漂移 12

灵敏度 9

灯寿命 24

气泡 7 在检测生物样品时可能为主要故障

池污染 6

其他 8

无故障 11

3.具体故障与解决

a.灯故障主要是灯失灵或能量衰减以及灯引起基线噪音。

除EC外，检测器中灯是重要部件。灯失灵，明显地引起检测器信号总下降。多数检测器有观察孔或指示器，由此可看见灯工作的情形。但是不可以直接观察紫外灯，因为紫外线会损伤眼睛。

基线噪音这是灯失灵更普遍的故障。氘灯打开后有30分钟的噪音，所以每次使用前至少预热30分钟。

换灯时要注意不能在灯上留下指痕。因为未擦去的指痕在开灯后会引起灯表面性的损害。请用软布或专用擦镜纸握住灯，在开灯之前用棉签蘸取甲醇擦去。新装上后至少要点燃1小时以上，才能开始定量分析。

b.池故障与解决

气泡是常见故障。瞬间而过的气泡会在色谱图上出现长噪音尖峰。若感觉到有气泡，当将等调整670nm左右，戴上防护便可以看到池内有一个圆环，并不是清晰地绿色图像。流动相脱气不足会产生气泡，池污染会使得故障加重。用充分脱气的流动相可以带走气泡，或用强溶剂通过系统。在正相和反向系统转换的时候一定要过渡。

检测器阻塞有下列现象：系统压力升高，松开检测器进口的接头压力降至正常水平。检测器部分易发生的地方为进口管道或热交换器、池本身和出口管道。用一般的净化的溶剂去掉阻塞可能不奏效但可以试试。若是厂家标明耐高压，可用泵打溶剂反冲，常可以去掉堵塞。压力不要超过6MPa.正常的池不可用此法，一般情况请咨询厂家的维护工程师较好。

c.池阻塞和污染，如确定是池堵塞，可用注射器回抽溶剂或用泵反冲（耐高压），一般能疏通。通常此故障较少发生，而污染是经常发生的。池污染一般是色谱图的噪音增大，灵敏度降低甚至不出峰，也提高了气泡的故障率。清洗池前向拆去柱和排空管道，准备好防护用品，如眼睛、围裙、橡胶手套等。池进出口都接上细管径的聚乙烯管。进口管上接10ml的注射器，出口管没入中。清洗程序如下：回抽10ml通过池去掉流动相残留。 回抽10ml蒸馏水 回抽10ml6mol/L，通过池去掉沉积物，此步应小心，要备有防止酸溢出的应急措施 回抽20ml蒸馏水 至少用100mlHPLC级别的水正向通过池。

d.池渗漏可能发生在接头、池窗的密封垫上，也可能发生在样品池或参比池的一侧，或者是石英窗破裂。除了接头松动，池渗漏也可能是管道阻塞、流速较高、池后的阻力大，使池的横截面承受过高的压力，地引起池破裂。也可能组装不当、垫圈不密封造成的渗漏等。没有多大把握请厂家来维护。

e.测量和参比池配合不当，正常情况下UV检测器用空气做参比，电路设计也无流动相本地。用有紫外吸收的流动相通过UV检测器，或是用示折光检测器都要在参比池内注满流动相。如参比池中流动相不与测量池中的流动相一样，本底输出信号不为零，进样时有可能出伪峰或倒峰。从湿参比池换成空气参比池时，要清洗干净后用干燥的氮气吹干，不能留下溶剂残留，否则就出“气泡样”的故障。

f.波长方面的问题主要是次级发射效应、选择波长不正确、波长的装置、波长校正问题、低波长测量问题和单色器等问题。

次级发射效应在可见光范围内，使用氘灯做光源可提高灵敏度，但是带来了次级发射效应。单色器能发射比设定值高一级的发射光，正好是设定值的一半。如设定值在405nm，次级发射光正好是202.5nm，发射光低于干扰波长之下，由于大气中的氧所吸收。次级发射光正好在紫外光范围内，即是检测器在两种波长下检测，违反了比尔定律，结果是非线性的。我们可以用钨灯在紫外范围内无次级发射，但是灵敏度下降。用氘灯在高于360nm测定，应考虑有次级发射的可能。在荧光检测器中，也有这个问题存在。

选择波长不正确可影响实验结果的性，如有可能应选择在干扰组分的吸收光谱平稳的范围或组分的吸收处。在所选波长太靠近流动相的吸收范围，梯度洗脱时会增加基线漂移。

波长的装置，可变波长UV检测器所采用的机械转动光栅选择波长。旋转和光栅间的传动装置由齿轮和杆组成，用久了会机械磨损，所选的波长并不真正是您选择的波长。

波长校正问题我们可以用在275nm校正吸收波长等方法来处理。

低波长测量问题是我们在采用低波长时，样品和流动相的变化比在高波长下更灵敏。我们要选择应选择低波长吸收较小的溶剂，通常是乙腈好于甲醇。

单色器问题主要是光栅和镜子蒙上一层污染物，一般这种情况请厂家维护较好。

g.时间常数是相应时间的设定，起着过滤噪音的作用。有些有固定的时间常数，有些需要自己设定。如果太小可能增加短噪音，时间常数太大可能出宽峰、峰拖尾和短峰。可用自己的经验估算时间常数，即选窄的有关峰宽的10%作为时间常数。

h.泵噪音主要引起检测器折射率的变化与流动相的组成、压力以及温度由引起的噪音。一般情况要加阻尼器，特别是RI检测器对波动十分敏感。。

I.温度的影响，主要是环境温度变化常引起基线漂移，一般情况请使用柱温箱等设施或环境温度波动的控制。

j.混合问题，主要是流动相不完全混合可出现周期性的基线变化，在示折光检测器非常，如果改用手动混合相对较好。特别是比例悬殊太大时明显。

k.线性问题，主要因为检测器或方法上的问题，非线性响应是可能的。如仔细稀释样品、选择波长，良好的方法可以延长线性范围。检查线性要在一定的浓度范围内，用不同浓度的标准品证实线性的相关性；用几乎澄清的溶剂做流动相可扩展线性范围，用强紫外吸收的流动相检测器线性范围几乎不到零，建议用无吸收的流动相或在流动相无吸收的波长下检测。

l.信号线故障主要是记录器和数据系统连接检测器的信号线引起的。要注意正负是否接对或线路松动、接触不良。另外就是有良好的接地装置。

m.内部自检没有通过，我们可以通过其提示信息参阅手册来解决，咨询厂家维护工程师。

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高效液相色谱法常出现的故障及解决的方法

常出现的问题有：

1、漏液

原因：换色谱柱或过滤砂芯时未拧紧

处理方法：拧紧接头处，下面垫滤纸以检查在液相工作时是否还有液体漏出

2、压力高

原因：过滤砂芯或过滤烧结头堵塞；色谱柱筛板堵塞或固定相吸附东西；管路，长菌

处理方法：更换过滤砂芯或过滤烧结头；柱子使用时间过长，更换色谱柱；清洗管路

3、基线噪音大

原因：色谱柱内存有杂质，流通池

处理方法：打开色谱柱出口端，冲洗色谱柱将物冲出

4、压力指示不稳，又无液体流过

原因：大量气泡进入泵体

处理方法：在脱气的同时，用一个针筒在泵的出口处帮助抽出空气

高效液相色谱仪的使用和原理分析

高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。

一、使用的问题

1、的洁净问题。

高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃后，干扰峰消除。

2、塑料的溶解问题。

近年来，一次性塑料给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意对的溶解现象，在利用此种提取样品时，有些(如等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐的玻璃了。

3、被测样品在壁上的吸附问题。

这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗物监测(TherapeuticDrugMonitoring,TDM)中，有些被测物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃的管壁上，因此，作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。

二、作进样阀的问题

目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。

1、进样量的控制。

用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误。

2、进样阀的清洁问题。

如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时，再以流动相清洗几次，每次用量还是40ul；c.，再将样品注射到进样阀里。

按照上述的步骤作，可以避免由进样阀引起的污染，从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。

3、进样阀溢流管的堵塞。

有时，进样阀的溢流管会发生堵塞现象，向进样阀内注射样品时，注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液，而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时，可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡，端口处盐的结晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次进样完成之后，用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出，则可避免此故障的发生。

三、流动相(MOBLLEPHASE)的问题

甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂是高等级的专用试剂，如色谱纯试剂。在要求不太严格时，优级纯甚至分析纯的试剂也能用。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器，因此，从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑，应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。

1、流动相的过滤。

配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒，如果不把它们滤除掉，就会堵塞泵口、柱头上的过滤器，这样就堵塞了流动相的正常通道，使色谱柱的阻力增加，柱压升高，柱效下降。碰到这种情况时，要换用经过滤的流动相，并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的水溶液中以清洗机清洗20分钟，以除去滤片上的堵塞物。

2、流动相的脱气。

流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体，否则，这些气体会使柱填料的性能降低，还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法，如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡，如果不脱气就使用，气泡就会进入色谱柱和检测器，并将影响分析工作的正常进行。

四、色谱柱的使用和保养

色谱柱是高效液相色谱仪主要的部件，被测物质能否被很好的分离和测定，色谱柱的性能起着决定性的作用。因此，在日常工作中，应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养，以延长色谱柱的使用寿命。

1、使用预柱和保护柱。

预柱(pre-column)安装于泵和进样器之间，它给色谱柱中的流动相提供了完全的平衡，并防止了对柱填料有破坏作用的组分或污染物进入色谱柱。保护柱(guardcolumn)可以阻挡能够牢固地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱，保护柱应与色谱柱的填料相同。预柱和保护柱可以经常更换，而不需要经常更换色谱柱，这就延长了色谱柱的使用寿命。

2、防止气体进入色谱柱。

有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相，并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入；c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；d.如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。

3、色谱柱的清洗。

为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例，因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用的甲醇或使用异丙纯、等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来，洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液，则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐，然后再用合适的溶剂来冲洗。

凝胶滤过色谱法(GelFiltrationChromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相，用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续作，可以将缓冲溶液置于柱内过夜，但是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出，如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜，也必须要用蒸馏水将色谱柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀。

4、色谱柱的存放。

如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：

a.几天之内的短期放置，应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗)，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了，这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱则可用正已烷或庚烷，而凝胶柱则不能用水了，因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱，再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时，一定要将色谱柱的两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的降低。

c.色谱柱应贮存在室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC 仪器对于准确度、度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

高效液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

扩展资料：

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC 仪器对于准确度、度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

ABOUT

高压输液系统

高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。其中，高压输液泵是高效液相色谱仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa。输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。因此，输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和分析结果的可靠性。

进样系统：进样能在试样引入色谱柱，有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

色谱分离系统：色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。常用的填料为硅胶，可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。其中、常用的是键合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

检测系统：检测系统用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。

根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱检测器(MSD)、蒸发光散射检测器(E)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)。

数据处理系统：高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据。

高效液相色谱仪的色谱柱堵塞了怎么解决？

不要反冲，有损寿命。一般的话，堵了的应该是柱内的过滤片堵塞，可以拿超几分钟看看，不行的话应该是柱子堵塞，可以把色谱柱头上方挖掉一点填料，重新填补(慎用，也会损伤色谱柱) 使用时加上保护柱！

色谱柱堵塞的话会造成峰宽展。其实色谱柱被堵塞的典型标志是柱压升高。

对于C8和C18色谱柱来说，进行反冲就可以了，高水相低有机相的混合溶液，小流速进行冲洗，冲洗的过程中不要接检测器。

高效液相色谱的常见问题比如说基线不稳

1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。） 1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图

2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。） 2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

3、流通池被污染或有气体 3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的。（不要用盐酸）

4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线） 4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5、流动相配比不当或流速变化 5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时 6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。 8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

9、使用循环溶剂，但检测器未调整。 9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

10、检测器没有设定在吸收波长处。 10、将波长调整至吸收波长处