亚细胞定位预测 亚细胞定位预测结果分析

对于一个基因，生物信息学分析都要分析什么？

1. circ' f2 E& V. |. @2 h) [7 h" a) `7 v5 z5 5 b# D ?) mRNA定量验证

生物信息学分析：

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3. 每个siRNA设计对应的对照，backspl junction位点一端互补配对，另一端错配，如图3所示。

基因结构预测；功能注释；蛋白结构预测（跨膜域、信号肽）；同源基因分析；亚细胞定位预测；启动子序列分析；调控靶基因的miRNA预测。。。。。。

生物信息swissprot数据库预测亚细胞定位结果怎么看

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1、首先拿出手机，打开浏览! ` Z0 j$ n% W! g, n1 J器。

3、点击链接4. circRNA敲除查看即可。

targetp结果分析怎么看

如何预测一个基因的亚细胞定位

预测分类等。2. circRNA Northern blot验证

1、TargetP的主要目标是预测蛋白质的亚细胞定位，结果给出蛋白质的分类。

2、其次在浏览器搜索栏输入生物信息swissprot数据库预测亚细胞定位结果怎么看进行搜索。2、TargetP还为每个预测结果提供了得分，较高的得分表示预测结果的可靠性较高。

如何做环状RNA的功能验证

随着去除核糖体测序技术深入发展，越来越多的环状RNA（circRNA）不断发现，基于生物信息学分析显示circRNA发挥着极其重要的生物学功能。然后如何采用实验手段进一步验证circRNA的生物学功能显得尤为重要，本文带大家一起探讨circRNA功能验证策略。

circRNA定量验证手段与常规PCR手段不同，常规手段是围绕目的片段的上下游分别设计PCR引物，称之为convergent primer，需扩增的片段位于上下游引物之间（如图1.1）。而对于circRNA，尤其外显子环化circRNA，除backspl junction位点处不同于linear RNA之外，body区与linearRNA是一致的。因此，验证时需要特异性针对backspl junction位点处设计primer，称之为divergent primer（如图1.1），而且设计的PCR product的长度越短越好，可以增强backspl junction位点处扩增效率。

图1.1 convergent或者你在NCBI数据库中比对到了编码类似蛋白的基因，如果该基因有人做过亚细胞定位的实验，你也可以大概知道其编码的蛋白质在细胞内部的定位。不同物种，不同基因家族成员有可能有区别。最终还是需要实验来验证的。 primer vs divergent primer

为增强过表达策略：1. 扩增目标区域包含circRNA侧翼Alu序列或内部碱基互补序列，侧翼上下游1kb处过表达效哺乳动物细胞中的剪接机制使外显子连接复合物(EJC)处于mRNA剪接连接处。本期Cell发表的两篇文章表明EJC与多种翻译控制有关联。Ma等表明EJC使mTOR信号传导途径下游的翻译活化，而Isken等证明，参与无意义突变介导的mRNA降解（）的EJC的结合分子可抑制翻译。率更佳；2. 目标区域扩增基于基因组DNA为模版。circRNA的验证效率，起始模版需满足以下要求（3 free）：1. DNA free；2. rRNA free；3. linearRNA free。

验证策略：对3free RNA以及genome DNA同时进行PCR扩增，电泳检测PCR product大小（如图1.2）。

图1.2 circRNA引物扩增结果

Northern blot方法是一种比较古老但行之有效的序列验证方法，需围绕circRNA设计探针序列，而探针序列设计是验证成功至关重要的环节。对于circRNA探针设计，我们建议以下两点：1. 对于外显子环化circRNA，建议探针尽可能跨backspl junction位点；2.对内含子环化circRNA，可围绕内含子区域设计探针。

验证策略：对3 free RNA、total RNA以及genome DNA同时进行杂交验证。

circRNA过表达思想主要源于circRNA生物形成机制，已有多篇文章circRNA成环机制，目前比较公认的成环机制为circRNA侧翼序列的碱基互补配对，称之为Alu结构（如图2）。

图2 circRNA侧翼结构特征

基于circRNA侧翼Alu序列特征，PCR扩增含侧翼Alu序列的目标DNA序列，随后依据对应限制性内切酶位点进行酶切，进而连接pEGFP-C1载体。连接载体进而转染对应细胞样本，定量PCR检测转染效率。基于divergent primer验证circRNA过表达倍数。

敲除策略：

1. 外显子环化circRNA，针对backspl junction位点前后序列设计siRNA，如图3所示；

GOC注释是什么意思？

; Z: B% T7 ^9 @. a! @+ P! P 识别并启动带有早熟翻译终止密码(PTC)的mRNA的降解。对从细胞中清除因DNA突变、无效DNA重排或mRNA错误加工产生的含PTC 的mRNA非常重要。另外，在某些真核生物中调节相当一部分正常基因的表达。在真核生物中，复合物的保守的蛋白质核心包括Upf1、Upf2和Upf3蛋白。作为RNA解旋酶的Upf1是关键作用因子，它与翻译终止和复合物的形成有关。在大多数多细胞生物中，Upf1的磷酸化和脱磷酸化循环对非常重要。这些循环由SGM1、SGM5、SGM6和SGM7介导。由Upf1复合物标记的含PTC的mRNA在P体中最终由参与一般mRNA降解的因子降解。

GOC注释可以提供大量可靠的信息，如基因和蛋白质的分类、功能、配体和亚细胞定位等，这有助于研究人员更好地理解生命过程。同时，GOC注释还对基因组学、蛋白质组学和转录组学等领域的研究产生了重要影响。在新研发和生物工程方面也有广泛的应用SKAR与EJC的结合是令人惊讶的发现，因为先前有关体外剪接的mRNP的纯化研究未鉴定出SKAR。一个可能的解释是SKAR可能与部分EJC结合在一起。由于SKAR有一个RNA结合结构域，一个令人感兴趣的可能性是SKAR可能优先与一类特定的mRNA结合（如与受S6K调节的重要标靶结合）。，这些领域需要大量的生物情报学数据来支持其研究和发展。

随着科技的发展和生物学研究的深入，GOC注释也在不circRNA敲除思路主要针对circRNA backspl junction处序列信息设计siRNA，对于内含子环化circRNA，也可针对内含子区域设计相应siRNA进行干扰。Divergent primer验证circRNA敲除倍数。断更新和进步。现在已经有很多具有高度性的注释工具和算法。在GOC注释的方法和标准上也在不断演变和改进。这将有助于进一步推动生命科学研究的发展，对我们理解生命的本质和研究疾病的起因和治疗提供更深入的认识和思考。

帮我一些文献：关于EJC（外显子连接处蛋白结合位点），要理论预测的。。

3. circRNA过表达

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9 K( ]$ g Q9 B/ `# O

真核生物信使RNA(mRNA)不仅含有作为蛋白质合成模板的整个开放读框，而且含有调节mRNA的细胞核输出、亚细胞定位、翻译和稳定性的信息。大多数这类信息由包括mRNA—蛋白质(mRNP)在内的与mRNA结合的蛋白质携带。然而，这些反式作用因子的获得并不完全是由转录产物的初级序列决定。前mRNP组分在其加工的每一步（包括前mRNA的转录、聚腺苷酸化、剪接和输出）都有很大的变化。对于理解真核生物基因表达调节来说，关键问题之一是测定mRNP在细胞核中的经历怎样影响它在细胞质中的功能以及怎样影响相关蛋白质的产量。) a) Q! { o4 Z: j- E& f# _. o; n

o8 s" G+ ~! ~6 G# _ J mRNA在细胞核中的经历可影响其在细胞质中的命运的证据之一来自对哺乳动物细胞中无意义突变介导的mRNA降解()的分析。是指带有早熟终止密码子的mRNA（它可能为有害蛋白质编码）被选择性地识别和摧毁的过程。在哺乳动物细胞中，早熟是指终止密码子至少距离3’剪接处上游50个核苷酸。的发现清楚表明在细胞质进行的mRNA降解某种程度上由细胞核中发生的反应控制。由于发现了外显子连接复合物(EJC)，因子可以在分子水平上解释上述观察。

2. 内含子环化circRNA，除针对backspl junction位点前后序列设计siRNA序列以外，也可针对内含子区域序列设计siRNA。3 s9 M. X6 P! E9 u, j5 o6 D1 S

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TOR信号传导途径在细胞生长调节中起关键作用。TOR受一个复杂的细胞外信号传导途径级联给出的各种细胞外信号（包括氨基酸浓度、激素等）的控制。TOR为几个细胞机制发送信号，包括通过S6激酶(S6K)向翻译起始复合物发送信号。$ ?0 t A3 X& B1 ` P4 ~

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尽管早先的工作已揭示了EJC可影响翻译效率，但Ma等的研究进一步给出了这种影响产生的机制。Ma等也给出了在与CBC因子结合的抑制性复合物中，同时存在几个可被S6K1磷酸化的因子。进一步研究S6K1的聚集对EJC介导的翻译效率增加是否足够或是否还需要其他因子的参与，是很令人感兴趣的。+ i I1 Y u' Z! K+ J: k

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Ma等的研究为EJC促进翻译的机制提供了出人意料的解释，因为在相同时间有一篇相反的，表明在过程中，EJC复合物有抑制翻译的作用。这些发现其实并不EJC的一个重要特征是它能将新形成的mRNA与已得到翻译的旧模板加以区分。Blenis及其同事所的观察的一个关键点是mTOR/S6K1途径专一性作用于新合成的mRNA。细胞通过这个机制进一步刚启动的基因产生蛋白质。这种可缩短在转录诱导和下游生物学效应之间的总滞后时间。这一点对真核生物特别重要，因为在真核生物中，可被翻译的mRNA的产生是一个漫长的过程。前mRNA的合成需要几十分钟，在极端例子中需要几小时，随后是复杂的mRNA加工步骤。mRNA合成的冗长过程可妨碍细胞对外部作出快速响应。通过EJC、SKAR和mTOR/S6K1途径使新合成的mRNA的翻译受到定向可弥补mRNA产生的缓慢速度。由于轮翻译可去除EJC，上述影响的持续时间可能很短并只限于少数翻译起始过程，除非在EJC解离后，参与翻译起始的S6K1底物仍保持与mRNP的结合。3 `) Q3 W ?' c$ x6 t" P# F. {矛盾，而是强调了EJC在翻译控制中的关键和不同寻常的作用。! G4 ^ R+ c+ I! v! n. x/ w

, W3 ]) H3 W! p3 f1 C9 C在过程中Upf1的活化可抑制翻译4 x. W+ {- q3 c' y3 E+ b9 e

% ]2 f7 z0 @( C) L7 K1 {9 Q# @: G @3 N9 Z

将PTC与正常终止密码进行区分是的必须步骤，但尚未得到全面研究。一个重要的模型是，除了翻译复合物对终止密码的识别，对早熟终止密码的识别还需要有一个终止密码下游的信号。在酿酒酵母、果蝇和线虫中，这种信号可能来自由PTC造成的长度异常的3’ UTR，尽管信号产生机制尚不清楚。当PTC位于外显子边界下游>50核苷酸时，可诱导。除了几个例外，大多数正常终止密码位于一个内含子的下游，缺少内含子的含PTC的基因不发生。通过Upf3和Upf2的先后结合，EJC向复合物提供有关内含子位置的信息。( D7 c( s) X" N; i) P |/ L' ^

目前的研究表明，的启动可能遵循下列步骤：（1）在轮翻译中，停止在PTC上的核糖体通过Upf1与翻译释放因子eRF1、eRF3以及SMG1的相互作用形成SURF(SMG1-Upf1-eRF1-eRF3)复合物，从而使核糖体与Upf1结合。（2）这种过渡性SURF复合物使核糖体与下游结合了Upf3和Upf2的EJC结合。（3）Upf1和SMG1与结合了EJC的Upf2的相互作用启动SMG1对Upf1的磷酸化。（4）所产生的复合物（包括EJC、Upf3、Upf2和磷酸化的Upf1）是诱导mRNA降解的关键信号。) J" E+ w3 ^: v8 {; i: W

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Isken及其同事在其新研究中给出了在的一步中，磷酸化的Upf1新功能的分子细节。他们的研究表明，除了启动含有PTC的mRNA的降解，Upf1还可减弱与其结合的mRNA的翻译起始。通过小干扰RNA 使Upf1下调可显著增加为荧光素酶编码的报告mRNA的翻译效率。当用丙肝的内部核糖体进入位点(IRES)驱动荧光素酶报告mRNA的翻译起始时，也可观察到类似的影响。这种IRES驱动的翻译起始与经典的依赖于5’帽的翻译起始不同，它不需要有与5’帽结构结合的翻译起始因子，可直接与核糖体40S亚基结合。在需要起始因子eIF2—起始tRNA和eIF3的反应的活化80S核糖体可进行这种转换。Isken等观察到当荧光素酶的翻译依赖于蟋蟀麻痹(CrPV)的IRES时，Upf1的下调对翻译几乎没有影响。CrPV通过不依赖翻译起始因子的机制，进行IRES介导的翻译。这个结果说明Upf1具有早先人们设的翻译起始的作用。Upf1的这项功能对是必需的，因为如果的公认标靶β-球蛋白PTC-39 mRNA的翻译通过CrPV IRES起始，该mRNA则不进行。尽管可能性不大，但上述结果还可作如下解释：这种由CrPV IRES驱动的特殊翻译起始方式可阻止Upf1与翻译终止复合物的有效结合。# S6 I& L7 o4 F# N, _( n& T% j

4 X y6 k3 L" }8 J& s 在mRNA降解之前的过程中，Upf1的磷酸化是一个关键步骤。Isken等研究了Upf1磷酸化的作用，发现这种磷酸化可抑制翻译起始。人们可以想象磷酸化的Upf1对翻译起始的抑制是间接的，是活化mRNA降解的结果（可除去mRNA两端，包括5’端帽结构和3’端poly(A)尾）。这些结构与关键翻译起始因子结合，包括在先驱翻译中，eIF4复合物与帽结构结合过程中的CBC因子，以及poly(A)结合蛋白与poly(A)尾的结合。然而，Isken等的结果表明，Upf1最有可能直接作用于翻译起始阶段。首先，他们展示了eIF3复合物的组分与Upf1共免疫沉淀，当Upf1高度磷酸化时，可增强共免疫沉淀反应。另外，重叠蛋白质印迹测定表明Upf1与eIF3的大亚基eIF3a相互作用。第二，他们使用了能在体外进行翻译，但无mRNA降解的兔网织红血球溶胞物。他们通过蔗糖梯度沉降，监测核糖体亚基在合成的mRNA底物上的组装，发现高度磷酸化的Upf1对40S亚基—起始tRNA复合物与mRNA的结合没有影响。但高度磷酸化的Upf1（非野生型Upf1）可阻止40S亚基—起始tRNA复合物转换成可进行翻译的80S核糖体。 z. a2 T& X. ( `0 A# C# u

# + A9 w+ `6 {6 j Iksen等根据观察，将最新发现的Upf1功能与流行的模型进行整合。在有早熟翻译终止的轮翻译中，Upf1通过形成SURF复合物与核糖体结合。然后Upf1和SMG1与下游的EJC结合，启动SMG1对Upf1的磷酸化。磷酸化的Upf1在这个阶段不但可使mRNA降解因子聚集（聚集机制尚不清楚），而且与eIF3接触，阻止进一步的翻译启动。有趣的是，最近的研究结果表明，eIF3参与翻译终止之后的核糖体循环，这说明在翻译终止过程中，Upf1和eIF3的位置可促使它们相互作用，阻断进一步的翻译。这种机制可防止合成半截蛋白质。另外，这个过程可从翻译机器中释放mRNP，使其与降解机制接触，并运转到P体以供降解。Upf1的这种双重功能与下列观点一致：的最终目标主要是防止合成异常蛋白质，而不仅仅是为了减少mRNA的半寿期。

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6 C- x( h" X" t! W" S 然而，Isken等的复杂结果表明事情可能更为复杂。他们观察到，通过siRNA使Upf2或Upf3的特殊形式Upf3b（也称为Upf3x）下调可阻止的发生，但不影响翻译。这项观察说明不同程度磷酸化的Upf1对翻译抑制和mRNA降解是必需的。人们可以想象磷酸化的Upf1参与的翻译抑制可能是于的过程，需要有进一步的研究来测定这两个过程的关系。测定Upf1是否在其他生物中也影响翻译起始同样很重要，因为有证据表明酵母中的可使翻译受到抑制。对诱导活化的Upf1的结合信号的深入研究，有助于了解Upf1在mRNA降解和翻译下游的作用模式。

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前景

真核生物中mRNA产生和蛋白质翻译的区室化使这些过程的效率提高，尽管这种区室化使真核生物的基因表达比原核生物的基因表达慢。mRNA产生和翻译在物理上的不偶联可能使人很难将新产生的mRNA与旧的mRNA相区分，但在哺乳动物细胞中情况有所不同。EJC在哺乳动物细胞中有分子标记的作用，细胞可通过EJC将旧转录产物与新合成的mRNA进行区分。EJC核心部分建立的平台在几个转录后调节步骤中（包括mRNA的降解、细胞内定位和翻译），通过与特定因子相互作用发挥功能。可能还会发现EJC的其他功能。有趣的是，EJC的大多数功能都直接或间接与翻译的活化或抑制相关联。例如，mRNA的定位需要与翻译控制密切协调，以防止蛋白质在细胞内的错误地点产生。进一步的研究肯定会揭示EJC参与的翻译的增强或抑制怎样在相同的细胞中作用于不同的mRNA。EJC核心蛋白eIF4AIII与翻译起始因子eIF4A高度相似，可能是EJC与翻译高度相关的进化标记。令人惊讶的是，尽管EJC提供的基因表达控制有明显的优越性，但EJC复合物亚基的保守性只限于后生动物。另外，在没有EJC的生物中，如酿酒酵母，也存在、mRNA定位和剪接后mRNA的翻译增强等过程。新合成的mRNA还有一些其他可被重要细胞机制识别的特征，鉴定这些特征是很重要的。

2 Z7 D l) e) F1 ' y本文转自建人先生原创，感谢

如何预测蛋白质的亚细胞定位

& Y. . y9 S( s

预测蛋白质的亚细胞定位，是通过生物信息学的方法的。

功能基因研究中，经常会进行基因编码的蛋白质的亚细胞定位的，

如待定位蛋白真核细胞的mRNA帽的识别与帽结合复合物(CBC)或翻译起始因子eIF4E有关。mRNA帽的识别是翻译的关键步骤，因为它能确保只翻译完整的mRNA。CBC在细胞核中与新合成的mRNA的帽相互作用，在细胞质中的先驱翻译过程中促进mRNA的翻译。对哺乳动物细胞研究得到的证据说明，在轮翻译过程中，有对早熟翻译终止密码(PTC)的识别，也有的发生。Bienis及其同事根据这些观察，测试了哺乳动物TOR(mTOR)途径是否影响参与先驱翻译的特定蛋白质的磷酸化。为了检测潜在的磷酸化的S6K标靶，他们对与CBC共沉淀的蛋白质进行了分析，发现在先驱翻译过程中有几个未曾鉴定的因子也是mTOR途径的参与者。另外，这些研究人员发现mTOR和哺乳动物的两个S6激酶中的一个(S6K1)与这些未曾鉴定的因子结合。这些数据揭示了mTOR途径可能和刚刚输出的mRNA的翻译相互连接，引发了对连接这两个过程的因子的研究。对潜在作用因子的研究表明，一个早先鉴定的S6K1底物SKAR(S6K1 Aly/REF类标靶)可使S6K1与标靶mRNP结合。SKAR有一个RNA结合结构域并可在细胞核和细胞质中穿梭，这两个特征与将TOR/S6K信号传递到新mRNP的作用吻合。SKAR可专一性地与在体外形成的EJCGOC，全称Gene Ontology Consortium，是基因本体论的一个集体。GOC注释是将GOC分类标准应用到基因组信息中，实现对基因功能的分析和注释。通过这样的方法，可以将基因与其所编码蛋白质的功能联系起来，从而更深入地研究基因在生物过程中的作用。结合，这种结合对S6K1下游标靶的磷酸化是必需的。最重要的是，用小干扰RNA(siRNA)对SKAR、S6K1和EJC进行敲除后，发现它们都参与促进剪接后的mRNA的翻译。综合这些数据，Blenis认为mTOR途径通过SKAR使S6K1与新剪接的mRNA结合，参与翻译。1 i' h% {7 [4 a+ d# Q2 d和GFP、YFP、RFP等融合后，观察融合蛋白在细胞内的定位，

或者将预测部位（如该蛋白可能在液泡膜上）的蛋白提取出来，进行western实验，来验证等。

希望对你有帮助吧

亚细胞定位时为什么还要照叶绿体的红光

mTOR信号传导和EJC. h' J$ l7 ?1 `4 K5 Q

预测蛋白质的亚细胞定位，是通过生物信j0 y: n$ m Q% F 在哺乳动物细胞中EJC与剪接一起形成，在剪接连接点上游24核苷酸处与新产生的mRNA紧密结合。EJC与成熟mRNA一起运送到细胞质，在mRNA翻译之前一直保持与mRNP的结合。尽管EJC的核心部分在mRNP成熟过程中保持不变，但在细胞内mRNP的形成中，EJC的周边蛋白不断与mRNP进行结合和解离。EJC参与各种细胞过程，包括mRNA的核质输出、亚细胞定位、质量控制和翻译。Ma和Isken等在本期Cell发表的两篇研究报告详细揭示了EJC及其结合蛋白活化和抑制翻译的机制。+ T. u& d p$ ^6 ~2 x息学的方法的。或者你在NCBI数据库中比对到了编码类似蛋白的基因，如果该基因有人做过亚细胞定位的实验，你也可以大概知道其编码的蛋白质在细胞内部的定位。不同物种，不同基因家族成员有可能有区别。最终还是需要实验来验证的。功能基因研究中，经常会进行基因编码的蛋白质的亚细胞定位的，如待定位蛋白和GFP、YFP、RFP等融合后，观察融合蛋白在细胞内的定位，或者将预测部位（如该蛋白可能在液泡膜上）的蛋白提取出来，进行western实验，来验证等。希望对你有帮助吧

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