流式细胞仪在临床诊断中的应用 流式细胞仪综述

[流式细胞术的原理及临床应用]流式细胞术原理

流式细胞术原理：待测样品(如细胞、微球、或细菌等)被制成单细胞悬液，在一定压力下被鞘液包裹着形成单列的细胞进入流动室，并与激光束相交。细胞被激光激发后产生散射光和荧光，经光电转换器处理后变为电信号，在电脑上以数字信号的形式展现出来。

流式细胞仪在临床诊断中的应用 流式细胞仪综述

流式细胞仪在临床诊断中的应用 流式细胞仪综述

流式细胞术的实验原理是什么？主要有哪些应用

简单的给你概况一下：

细胞或者大小接近的颗粒物质都可以检测。样本通过鞘液的输送，成单个队列依次通过激光束。样本事先可以根据检测需要被荧光标记，通过激光束的时候就会得到荧光信号，被记录下来。可以同时标记不同的荧光标记做不同的检查。优点就是可以在短时间内检测大量的样本（每秒几千个到几万个细胞）。

主要应用于各种生物医学研究和临床诊断。上通用的白细胞和淋巴瘤的诊断标准就是靠流式细胞仪的分型来确定的。

流式细胞仪可以分选循环肿瘤细胞吗

在一些癌症患者的血液中，人们发现了罕见的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTC）。这些细胞被认为以某种方式从恶性肿瘤释放到血液中。此外，它还可能参与了继发肿瘤形成的转移过程。

如此看来，CTC对癌症研究很重要。当然，它也是相当复杂。CTC通常是细胞角蛋白阳性（CK+）和CD45阴性（CD45-），但并非总是如此。在一些癌症中，上皮细胞粘附分子EpCAM存在于CTC表面，而另一些癌症却不是。CTC比淋巴细胞大，除了一些“小CTC”亚型。即使是来自同一位患者同一次抽血的样本，CTC也可能存在遗传异质性。

临床医生希望有一天CTC的液体活检分析能够取代侵入性的实体瘤活检。很显然，我们还需要深入了解这些复杂的细胞。此外，CTC在血液样本中的出现也有着预后的意义。CTC是癌症中的捣蛋，它们的存在与预后不良有关。

CTC的罕见又使得研究极其困难。在一大堆有些相似的白细胞中，CTC的出现概率大概是百万分之一。即使是病人，常规抽血的样本中也只有10个或以下的CTC。了解这种高度复杂而又极其罕见的细胞，成为临床研究的目标。

流式分析

难怪研究人员一直将流式细胞仪作为CTC分析的工具。“流式细胞仪在从异质样本中寻找稀有细胞的能力是的，”BD生命科学的市场部Trent Colville谈道，“针对表面标志物的荧光标记抗体实现了CTC的鉴定。”

随着细胞通量的升高以及作成本的降低，BD的FACSCanto II细胞分析系统及其他流式细胞仪正在解决这种大海捞针的挑战。多样化的流式检测技术正帮助研究人员揭开这些复杂细胞的奥秘。

Alison Allan等人探索了多参数流式细胞仪在这方面的应用，他们使用人乳腺癌的小鼠模型来模拟CTC分析的挑战1。作者发现，利用贝克曼库尔特XL-MCL流式细胞仪的前向散射能力可测定细胞大小，而三个荧光检测通道可测定HLA、CD45和非整倍体DNA内容，这有助于识别小鼠淋巴细胞中的人乳腺癌细胞。作者认为，通过去除CD45阳性的淋巴细胞，可初步富集CTC，增加实验的信息。

为了获得的结果，CTC的样品制备和分析应当轻柔而快速。“CTC是稀有、脆弱，并对时间敏感的，”赛默飞世尔的高级工程师Mike Ward指出。“如果你能减少样品制备步骤，那么你分析CTC的机会将会提高。Attune NxT流式细胞仪的大样品量是个优势，让你不再需要通过离心或其他方式浓缩你的细胞，那样可能会造成细胞损失或伤害。”

富集策略

事实上，任何CTC富集策略都需要将有CTC特征的细胞与没有这些特征的细胞分离，也存在CTC丢失的风险。为了减少这种风险，Tsvetana Hristozova等人开发出一种新的流式分析作，以检测上皮癌CTC 2。他们以电子阈值作来取代CD45+ 淋巴细胞的去除。

研究人员对BD的FACSCanto II流式细胞仪进行设置，以检测加在血液样本中的UT-SCC-23（鳞状细胞癌细胞），同时滤除细胞碎片引起的低前向散射信号，以及产生非CTC荧光图谱的细胞。结果表明，在数据采集过程中应用的电子阈值确实能省去CTC分析前的肿瘤细胞预富集。

之后，他们将这种方法应用在头颈部鳞状细胞癌（SCCHN）患者的真实血液样本中，发现电子阈值作检测到的CTC频率和数量与传统的免疫去除方法相当。作者的结论是，两种方法在分析SCCHN的CTC上同样有用，但阈值法更加经济，也更加省力。

在去年的美国癌症研究协会年会上，Amnis公司（默克密理博旗下）的科学家介绍了一种新方法。它利用多光谱成像以及Her-2和EpCAM的SmartFlare探针，这些靶定细胞内的RNA序列，而不是细胞表面蛋白。他们利用Amnis ImageStream MK II成像流式细胞仪来检测散发Her-2和EpCAM荧光信号的SKBR-3人乳腺癌细胞。

在白细胞过量10万倍的情况下，癌细胞的进一步鉴定是通过细胞大小和圆度分析来实现的。研究数据表明，这种成像流式细胞仪能够检测到十万分之一的肿瘤细胞。作者指出，在临床环境中，流式细胞仪所获得的细胞图像的分析可避免阳性的发生。

流式细胞仪用于CTC分析的优点可不少。细胞的高速流动让研究人员能克服百万分之一的CTC发生率。样品运行的成本相对较低，而且市场上有各种荧光染料和仪器可以选择，让研究人员能自由地开展实验设计。不过，流式细胞仪是否会成为液体活检的主要平台，这还难以预测。

当然，随着人们不断开发出更先进的试剂和仪器，能够快速、详细地拷问流动的细胞，流式细胞仪在CTC分析上的优势将日益明显。

参考文献

[1] Allan, AL, et al., “Detection and Quantification of Circulating Tumor Cells in Mouse Models of Human Breast Cancer Using Immunomagnetic Enrichment and Multiparameter Flow Cytometry,” Cytometry, 65A.1:4-14, 2005. [PubMedID: 15810015]

[2] Hristozova, T, et al., “A Simple Multicolor Flow Cytometry Protocol for Detection and Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells in Epithelial Cancers,” Cytometry, 81A.6:489-495, 2012. [PubMedID: 22438318]

流式细胞术的应用范围

1. 临床诊断：比如白血病、淋巴瘤的分型；造血干细胞的检测；TBNK和

2. 实验研究：只要细胞或者微球的大小在流式检测范围内，都可以用流式来分析各种抗原的含量或代谢状态等。

3. 细胞分选：有分选功能的流式可以把不同的细胞筛选出来，以便进行下一步的研究。

流式细胞术的用途是什么

细胞或者其他颗粒状的物体可以被荧光标记的抗体或者替他荧光染料染色。当这些被标记的物体通过流式细胞仪的时候，激光照射，得到不同的激发光。

用途：1. 临床诊断：比如白血病，淋巴瘤的分型，可以指导治疗。检测干细胞的百分率，可以判断干细胞治疗的效果等等

2. 实验研究。根据前面所说的原理。只要可以被染色的，都可以用流式来分析。可以检查各种抗原的含量。代谢状态等等。

3. 细胞的分选。，根据染色的状态，可以把不同的细胞筛选出来，进行下一步的研究。