常用的细胞分离方法有哪些 细胞分离有什么用

原代细胞分离提取方法及注意事项

原代细胞是直接取自活组织

常用的细胞分离方法有哪些 细胞分离有什么用

常用的细胞分离方法有哪些 细胞分离有什么用

常用的细胞分离方法有哪些 细胞分离有什么用

常用的细胞分离方法有哪些 细胞分离有什么用

例如活组织检查材料

的细胞，并建立用于体外生长。这些细胞经历了非常少的群体倍增，因此与连续

肿瘤或人工永生化

细胞系相比，它们更能代表它们所衍生组织的主要功能成分，使得原代细胞成为更具代表性的体内模型。

原代细胞分离是指将组织分散制成细胞悬液后从中获取目的细胞的过程，获得高纯度、高活性的原代细胞则是很多细胞实验成功的关键要素之一，原代细胞分离的方法有很多种：悬浮离心法、直接组织块法、酶消化法、非酶消化法、机械分散法等。

人或动物体内

或胚胎组织

由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3 的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下：

一、悬浮细胞的分离方法

组织材料若来自血液、 羊水、胸水或腹水的悬液材料， 简单的方法是采用 1000r/min 的低速离心 10 分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁 PBS 洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。

二、实体组织材料的分离方法

对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法

物理裂解

和消化分离法。

一机械分散法

所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内

用九号针

，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤

常用注射器钝端

使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。

二消化分离法

组织消化法是把组织剪切成较小团块

或糊状

，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。

消化分离法的作步骤

1剪切把组织块剪碎，呈 1~5mm3 大小的组织块。

2加液漂洗 将碎组织块在平皿

或三角烧瓶

中用无钙镁 PBS 洗 2-3 次

采用倾斜，自然沉降法

。3

消化 加入消化液

胰蛋白酶或胶原酶或 EDTA

于 37℃水浴中作用适当时间

中间可轻摇 1~2 次

，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。胰蛋白酶消化时间不宜过长。

4弃去消化液 采用倾斜自然沉降或低速离心法尽量弃去消化液。

5漂洗 将含有钙、镁离子的培养基沿瓶壁缓缓加入，中止消化反应，采用漂洗法洗 2-3 次后，加入完全培养基。

6机械分散 采用吸管吹打或振荡法，使细胞充分散开后用纱网或 3~4 层无菌纱布过滤后分瓶培养，若要求不高可采用倾斜自然沉降 5~10 分钟，吸上层细胞悬液进行分瓶培养。

注意事项如下

1组织块必须漂洗 2-3 次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和 EDTA 的抑制作用。

2胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。

3消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，以避免膨松的细胞随漂洗而丢失

三、酶消化法

1）无菌

确保使用无菌设备、试剂和技术收集和处理组织。使用个人防护设备以避免污染。使用0.22微米的膜无菌过滤所有酶和试剂。

2）切块

用无菌剪刀或手术刀将组织标本切成小块

通常为2×4mm

，然后将小块放入选定的缓冲液、培养基或盐溶液中。

3）加酶

将组织清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您选择的酶如胶原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，约0.5 mg/ml～1.5mg/ml的酶。

4）孵育

将组织样本在其温度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分钟。定期混合或轻轻摇动标本。

5）洗涤

通过轻轻移液来分散细胞

也称为研磨

，然后，使用细网过滤细胞悬浮液。让细胞沉淀并滗出多余的含液酶;洗两到三次。含有FBS，BSA或其他的洗涤溶液也可用于阻止酶消化。

6）分析

将细胞重悬于正确的培养基或缓冲液中，然后定量测定细胞产量和活力。这是细胞分离过程中的重要步骤，因此您可以评估解离技术的结果。大多数研究人员使用血细胞计数器测定细胞产量，并使用台盼蓝重氮染料测量细胞活力。

单细胞的分离方法有哪些

一、悬浮细胞的分离方法：利用离心方法对细胞进行分离。

二、实体组织材料的细胞分离方法：对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法( 物理裂解)和消化分离法。

细胞组分的分级分离时分离的方法有几种

试想一下，若没有各种方法来分离组成细胞的不同区室和组分，那么现代生物学将困难重重。从细胞信号通路 到新陈代谢，人们一直想知道，它们在哪儿，过去、现在及将来。

赛默飞世尔科技 的市场部Monica O’Hara Noonan介绍，研究人员对细胞进行分级分离(fractionate)的原因有很多。他们可能希望，当感兴趣的蛋白在某些条件下或某种处理之后转位时，对其进行。对细胞进行分级分离能增强低丰度蛋白的检测能力，或降低下游分析或功能分析的复杂性。

如果您正在从事这一方面的研究，请继续往下读。从细胞 上讲，我们会帮助您将小麦和谷壳分开。

细胞的组分

如何对细胞进行分级分离取决于很多因素，包括哪些仪器 、知识可以利用，您想要分离什么，以及这些组分的下游应用是什么。

离心是细胞分级分离中常用的技术之一，它们单独使用，或与其他方法结合。例如，对于高尔基体 或物酶体，大部分作都要求高速的密度梯度离心。然而，O’Hara Noonan也指出，超速离心也有一些缺点，包括超速离心机是高价的仪器，有些实验室无法接触到。另外，密度梯度难以倾倒是出了名的，其结果是技术依赖的。

当然，其他的许多组分也可以只利用试剂和台式仪器来富集。供应商开发出一些试剂盒，能方便快捷地带来高度富集的细胞组分。赛默飞世尔 全新设计的Mem-PER Plus试剂盒，能在一小时之内富集完整的膜相关蛋白。

据sigma-aldrich 的产品专家Michael Moehlenbrock介绍，这类试剂盒的原理在很大程度上是类似的。它们往往使用低渗缓冲液给细胞膜带来压力，然后用等渗的提取缓冲液(带或不带还原剂和蛋白酶)来维持感兴趣的细胞器。有时也需要机械裂解或去污剂裂解。“各个不同供应商在细胞分级分离试剂盒的设计上都是一致的，而不同细胞组分的异在于缓冲液组成、裂解试剂和离心速度，”Moehlenbrock说。

此类试剂盒的价值并不在于某些秘密试剂，而在于QC系统的一致性和重复性。“细胞分级分离的方法已经过充分鉴定，其作步骤适用于大部分应用，”Moehlenbrock说。“商业化试剂盒为终用户带来了简便和效率，同时提供了品质保证的安全性。”

通过改变穿插在离心步骤之间的缓冲液的去污剂组分，研究人员可分离不止一个组分。例如，市场上许多试剂盒可收集细胞核和胞浆蛋白。其他试剂盒也带来了三个或四个不同的组分。Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit产生了细胞质、细胞膜/细胞器以及细胞核/细胞骨架组分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分离出细胞质、细胞膜、细胞核和细胞骨架组分。

美天旎提供一种不含去污剂的试剂盒，它利用TOM22抗体标记的磁珠来特异分离线粒体。据该公司的技术支持介绍，他们不提供其他亚细胞组分的产品，但客户可以利用自己的抗体来间接分离其他组分。

同样地，赛默飞世尔的Cell Suce Protein Isolation Kit标记细胞表面蛋白的外部赖氨酸，它具有一个可切割的生物素衍生物，让此蛋白组分在细胞裂解后可被捕获。

其中有什么

在细胞组分被分离出来之后，必须验证您的实验，并确认这些组分确实包含了您要分离的。尽管这些试剂盒通常不包含区分各种组分的试剂，但许多会指出不同的看家基因，让您用来确保质量。Moehlenbrock表示：“在某些情况下，我们会提供分析的建议。”例如，Sigma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技术指南建议检查细胞色素c氧化酶活性和柠檬酸合酶活性，以确认外膜和内膜的完整性。

Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作为分级分离试剂盒的伴随产品。生产科学家Jim Cormier介绍，当您在运行Western时，您会得到一个量化值，哪些组分占多少。Sampler Kit包含细胞质MEK1/2、线粒体凋亡诱导因子(AIF)、组蛋白H3和细胞骨架波形蛋白的兔单克隆抗体，以及山羊抗兔IgG。

研究人员也可利用试剂盒中的建议，或搜索文献，组装自己的Western blot或ELISA试剂盒。不过Cormier也提醒，并非每个抗体都有着它应有的特异性。

下游的分析

与超速离心相比，基于试剂盒的细胞分级分离方法快速又方便，也适合多个下游应用，如EMSA、报告基因分析、酶活分析和Western blot。

然而，制备过程中所使用的去污剂和盐可能阻碍蛋白质组学的应用，如质谱，“这有时取决于去污剂的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O’Hara Noonan说。“在某些情况下，您可能需要透析或脱盐。”

同样地，有时可能需要额外的步骤，来增加产物的纯度。在读研究生时，Moehlenbrock一般使用台式离心机来制备线粒体。“有时我会用11,000 x g来去除细胞碎片。之后获得线粒体提取物，并用蔗糖梯度和超速离心机来进一步纯化。这取决于您想做什么，

如何选择的细胞分离方法

细胞分离方法在科学和临床实验室中被广泛推广，用于研究、诊断、或临床应用。大多数这些方法被限制于仅小量细胞。对于从大量非靶细胞分离细胞，磁性细胞分选或密度梯度离心是已经建立的技术。一种特别具有挑战性的分离方法是从全血中分离细胞，例如从全血中分离T细胞。为此，在分离或纯化靶细胞之前必须将红细胞排出。例如通过密度梯度离心可进行红细胞的清除；例如通过多功能抗体、多糖、聚乙烯酮、或聚氧乙烯和随后的离心进行外周血单核细胞(PBMC)样本制备、红细胞裂解、或聚集。在靶细胞分离之前排出红细胞的方法例如被公开于EP2597153A1中。在清除红细胞或另外不期需的细胞之后，需要采用接续的分离靶细胞的工艺步骤。

要研究细胞内各种细胞器的结构和功能，需要将这些细胞器分离出来。常用的方法是什么？

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